近期出版的《Cell》封面颇具西部风格，封面图片中带刺仙人掌（唾液酰化的粘蛋白）含有小花和小鸟（共生有益细菌），保护肠道组织免受蛇和鹰（病原体）的侵害。无刺仙人掌（唾液酸化的丧失）导致致病细菌入侵（蛇）。下面就跟大家分享这篇精彩文章“Sialylationiscriticalforintestinalmucusformation.”
图：Cell封面图，唾液酸化（带刺仙人掌）对于肠道黏膜的形成至关重要。
注：插图概念由川武设计，插图由艾伦·霍夫林创作
一、背景介绍肠粘膜屏障对于人体固有免疫来说十分重要，正常成人体内的肠粘膜屏障展开面积可达2平方米，同时其中还包含了大量的肠道细菌。肠粘膜上皮细胞、杯状细胞、内分泌细胞、刷状细胞、M细胞等形成致密屏障，并由粘液（Mucus）覆盖。如果肠粘膜屏障受损，可能会导致诸如炎症性肠道疾病，甚至导致结肠癌的发生。
图：肠道黏膜示意图
肠道粘液的稳态离不开糖基化修饰（Glycosylation），可为肠粘膜中的菌群提供必要营养支持。研究胃肠道屏障可以促进对肠道炎症性疾病的研究。而唾液酸化（Sialylation）是发生在粘蛋白（Mucinproteins）上的一种唾液酸末端残基的修饰，由唾液酸糖基转移酶（Sialyltransferases，ST）介导。尽管研究表明ST与肠道溃疡和肿瘤发生相关，但其在肠粘膜屏障中的作用还无人报道。
于是作者的科学问题可以归纳为：唾液酸化修饰对肠粘膜屏障有什么重要意义？其中关键的唾液酸糖基转移酶在其中有什么重要作用？为明确这个问题，作者使用细胞、类器官模型及单细胞测序等方法对此进行了深入探究。
二、文章结果1、唾液酸糖基转移酶6（ST6GALNAC1，ST6）在杯状细胞中过表达
作者在临床标本中发现肠道组织中ST6表达较其他ST亚型蛋白高，于是后文主要以ST6为切入点进行一系列探究。ST6mRNA、蛋白在结肠和胃肠组织（GIgastrointestinal）升高，在血浆、免疫细胞和其他器官中未升高。单细胞测序提示ST6在杯状细胞中增加，在其他肠道细胞和免疫细胞中较少。患者组织衍生肠道类器官中，杯状细胞中MUC2黏膜糖蛋白和高表达的ST6具有共定位，共聚焦发现ST6包裹在MUC2外围（下图I）。提示ST6在肠道杯状细胞中过表达。
2、ST6调控广泛的N糖基化
ST6在年被报道可以促进O糖基化，但是并没有报道N糖基化相关调控。作者使用酶促反应降解O或N糖基化，发现唾液酸信号降低，提示可能着两种糖基化都受到ST6调控（下图A）。敲除ST6后基因富集分析发现N糖基化有差异，对糖基化的MUC2蛋白进行组学分析，发现ST6和N糖基化中的唾液酸化具有直接关联，后续又通过ST6过表达实验证明ST6是MUC2唾液酸化修饰的限速步骤。
3、ST6决定肠道的稳态
因为S-Tn抗原由ST6特异性产生，可以代表ST6活性，所以作者通过免疫印迹实验检测S-Tn，发现MUC2蛋白与S-Tn具有交互作用，所以作者假设ST6介导的唾液酸化可以保护MUC2不受肠道细菌的降解，从而维持黏膜稳定性。通过细菌粘蛋白酶处理，证明ST6可以保护MUC2不被降解（下图FG）。
4、炎症性肠病患者ST6突变增加
在临床样本中作者发现肠炎患者ST6增加，并且出现一系列突变（下图），杯状细胞相关基因也增加，为检测ST6是否与肠道细菌相关，作者用无菌条件下饲养的小鼠和对照组小鼠进行比较，发现无菌小鼠肠道ST6高；相反，对照组小鼠肠道中TLRs相关菌群信号低则ST6低。临床病例中炎症性肠病中体系ST6突变增加，PAS染色法可观察到1号患者里面有混乱的杯状细胞，同时全外显子DNA测序发现ST6基因保守的氨基酸序列改变。提示尽管临床病理和免疫指标均正常，但是患者肠道组织的杯状细胞还是出现ST6的突变。
5、ST6突变改变其唾液酸化修饰
为探究ST6突变后的改变，作者构建ST6变体-EGFR融合蛋白的结肠癌细胞，电泳迁移实验发现RQ突变的ST6蛋白迁移更快，提示翻译后修饰消失（下图F条带47）。去糖基化处理使野生型ST6条带迁移，同时让S-Tn带消失（下图F条带），提示野生型ST6可以维持唾液酸化修饰，而ST6RQ突变明显降低唾液酸化修饰。
6、ST6缺陷突变易导致肠道炎症
为研究体内ST6如何发挥作用，在小鼠模型中，作者将ST6突变，发现N糖基化降低。共聚焦显微镜观察发现ST6突变小鼠肠粘膜内侧变薄，菌群定量检测发现ST6突变小鼠肠道内菌群变多，且患有严重肠道炎症疾病。使用混合抗生素ABX预处理菌群，ST6突变小鼠中的DDS肠炎可得到缓解。
7、ST6通过肠道菌群影响肠道干细胞稳态
为了探究ST6对肠道的具体作用，作者使用抗生素处理，发现ST6突变小鼠肠炎减轻，提示肠炎是由ST6失活突变状态下，肠道菌群所引发。而且小鼠粪便菌群中，ST6突变组菌群类别组成有较大差别，分泌代谢物也不同，在DSS肠癌小鼠模型中，是丁酸盐butyrate的过度累积抑制了ISC的生长，从而抑制肠上皮的修复。
三、文章总结这篇Cell文章封面让人眼前一亮，通过对糖基转移酶ST6作为切入点，利用单细胞测序技术、类器官染色等手段，对肠粘膜屏障的唾液酸化进行一系列探究。尽管机制没有做到特别深入，但是涉及范围非常广，肠道菌群、粘液层、肠黏膜细胞、免疫细胞群等均有阐述。此外还有临床与基础转化研究的启发：从3名患者的胚系突变家系图中找到糖基化转移酶的突变位点，并在小鼠和细胞模型中进行验证，再通过类器官、患者组织的染色，将肠粘膜唾液酸化稳态的机制可视化，值得借鉴。
图：文章机制
文章通讯作者为美国国立卫生研究院杰出研究员MichaelJ.Lenardo，研究方向为肠道免疫机制等。
参考文献：DOI:
